实验目的

(1)掌握几种常用的细菌染色方法。

(2)初步了解细菌的形态和结构特征。

细菌的个体形态主要分为球菌、杆菌和螺旋菌(图)3-1）。除了细胞壁、细胞膜等基本结构外，一些细菌细胞还具有孢子、荚膜、鞭毛等特殊结构，是细菌分类鉴定的重要指标。由于细菌细胞小而透明，在显微镜下直接观察时难以识别，因此通常需要染色才能观察形状和结构。生物染色染料主要包括碱性染料、酸性染料和中性染料。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时带正电荷，因此很容易与细胞结合，使细菌着色。因此，碱性染料主要用于细菌染色。常用的碱性染料有美蓝、晶紫、番红、孔雀绿等。

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图3-1细菌基本形态显微照片a．球菌；b．杆菌；c螺旋菌细菌染色的方法有很多，以下是几种常用的染色方法。

简单的染色方法：一种用染料染色细菌的方法。该方法操作简单方便，仅适用于观察细菌列。

丹麦病理学家Hans Christian Gram它成立于1884年，是细菌学中很重要的鉴别染色方法。革兰氏染色后，各种细菌可分为革兰氏阳性细菌（G＋）和革兰氏阴性菌（G-）两类。其基本步骤分为：结晶紫初染、碘液体染、乙醇（或丙酮）脱色和番红复染。一般认为，革兰氏染色原理与细菌细胞壁的结构和组成有关。G+细胞壁肽聚糖层厚，脂质少。乙醇脱色时，肽聚糖会因脱水而缩小网孔，降低渗透性，从而保留晶体紫色-碘复合物在细胞膜上，细胞呈紫色；G-细胞壁肽聚糖层薄，脂质多，乙醇溶解脂质，增加细胞壁渗透性，结晶紫色-碘复合物溶于细胞壁，番红复染使细胞呈红色。

芽孢染色法:芽孢是一种圆形或椭圆形的休眠结构，由某些细菌在其生长发育后期在细胞中形成(图3-2a）。细菌孢子壁厚致密，透气性低，不易着色。孢子染色法是根据孢子不易染色，一旦染色后难以脱色的特点设计的。在加热条件下用碱性染料孔雀绿染色，使染料不仅进入菌体，而且进入孢子。进入菌体的染料洗涤后脱色，孢子着色后难以洗涤脱色。当用对比度较高的复染剂染色时，孢子仍然保留初始染料的颜色，细菌被染成复染剂的颜色，使孢子和细菌容易区分。

荚膜染色法:荚膜是一种被细菌细胞包围的粘性物质，由多糖、糖蛋白或肽组成。由于荚膜与染料的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染色，即菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成透明圈(图)3-2b）。由于荚膜含水量高，生产过程中通常不需要热固定，以免夹膜变形，影响观察。鞭毛染色方法：细菌鞭毛非常细，直径一般为10~20nm，只能用电子显微镜观察(图)3-2c）。然而，如果使用特殊的鞭毛染色方法，也可以在普通光学显微镜下看到。鞭毛染色方法有很多，但其基本原理是相同的，即在染色前用媒体染料处理，使其沉积在鞭毛上，使鞭毛加厚，然后染色。

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图3-2细菌特殊结构的显微照片(引自)M.T.马迪根）a细菌芽孢；b细菌荚膜；c．细菌鞭毛

【实验设备】

1菌种金黄色葡萄球菌（Staphy loccocus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）或自备菌种。

2.染色液和试剂草酸铵结晶紫、卢哥碘液、95%酒精、番红、5%孔雀绿水溶液、绘画墨水、硝酸银染色液、二甲苯、柏油等。3.废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜、小试管（75mm×10mm）、烧杯、滴管、玻片架、镊子、吸水纸、记号笔等。

【实验步骤】

1简单染色法

(1)涂片:在干净无油腻的玻片中央放一小滴水，按照无菌操作方法(图)3-3）用接种环挑选少量金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌种，与水滴完全混合，涂上极薄的细菌膜。注：细菌量应适当，涂抹均匀，避免细菌过多导致涂层细胞积累，难以看到细菌的个体形式。

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   图3-3制备涂层的无菌操作过程a接种环灭菌；b．拔管塞；c管口灭菌；d．取菌种；e管口灭菌；f．塞管塞；g．涂布；h燃烧接种环

(2)干燥:让涂层自然干燥或用吹风机吹干。

(3)固定:手持玻片一端，让菌膜向上，通过火焰两三次(玻片背面不烫手为宜)。注意:涂层干燥后要加热固定，避免因固定时间过长而损坏细胞形态。

(4)染色:将涂片放在玻片架上，加入适量草酸铵结晶紫色液染色(以覆盖菌膜为宜)1~2min。

(5)水洗:倒入染色液，用洗瓶小水冲洗，直至涂片上的水无色。

(6)干燥:用吸水纸吸水，自然干燥或用吹风机吹干。

(7)镜检:涂片完全干燥后镜检查，从低倍镜到高倍镜，用油镜观察。简单染色法的操作流程见图3-4。

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图3-4简单的细菌染色法(引自M.T.马迪根）

2.革兰氏染色法

（1）生产：取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌斜培养物常规涂层、干燥、固定（同上）。注：应选择幼年培养物、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌24h。涂片宜薄，以免脱色不完全造成假阳性。

(2)初始染色:滴加结晶紫(适合覆盖菌膜)染色1~2min，水洗。

(3)媒染:用碘液冲去残水，用碘液覆盖约1min，水洗。

（4）脱色：将玻璃倾斜。在白色背景下，用滴管和95%乙醇脱色，直到乙醇刚好无紫色。注：革兰氏染色成败的关键是乙醇脱色。如果脱色过多，革兰氏阳性细菌可能染成假阴性；如果脱色时间过短，革兰氏阴性细菌也可能染成假阳性。

(5)复染:用番红液复染2min，水洗。

(6)镜检:干燥后，用油镜观察。

3。芽孢染色法

(1)制作:按常规方法将大芽孢杆菌涂片、干燥、固定(同上)。

（2）染色：在涂片上加入5%孔雀绿染色液，用木夹夹住载玻片一端，用微火加热酒精灯上方，用染料蒸汽而不沸腾，并开始计时5min。注：加热过程中不要让染色液沸腾，及时补充染色液，不要让涂层干燥。

(3)水洗:玻片冷却后，用水轻轻冲洗，直到流出的水中没有染色液。

(4)复染:用番红液染色2min。

(5)水洗:用水洗去染色液。

(6)镜检:干燥后用油镜观察。4.荚膜染色法

(1)混合物:在干净的载玻片上加入1滴墨水，挑选少量胶质芽孢杆菌菌体与其充分混合。

（2）覆盖玻璃：在混合物上放一个清洁的覆盖玻璃，然后在覆盖玻璃上放一张滤纸，轻轻压下，吸收多余的细菌液体。注：不要产生气泡，以免影响观察。

(3)镜检:先用低倍镜，再用高倍镜观察。

5.鞭毛染色法(硝酸银染色法)

(1)菌种准备:取经活化的苏云金杆菌。

(2)准备载玻片:将载玻片在含有适量洗衣粉的水中煮沸20min，取出，用清水彻底清洗，沥干后浸泡在95%乙醇中，用时取出烧在火焰上的酒精和可能残留的油渍。(3)菌液制备:斜菌种数环于1~2mL在无菌水试管中，制成菌悬液。

（4）生产：将细菌液滴在玻璃的一端，倾斜玻璃，使细菌液慢慢流向另一端，用吸水纸吸收玻璃下端多余的细菌液，室温自然干燥。

(5)染色:涂片干燥后，滴入硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水冲洗A液。用B冲去残水后再加液B液覆盖涂层染色数秒至1min，当涂层表面出现明显的棕色时，立即用蒸馏水冲洗。如果添加请添加。B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。

(6)镜检:干燥后用油镜观察，可从玻片一端逐渐移动到另一端观察。

【实验报告】

1．实验结果

(1)绘制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明革兰氏染色结果。

(2)绘制芽孢杆菌形态图(表示芽孢位置)。

(3)画鞭毛细菌的形态图。

2．思考题

(1)革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？

(2)观察芽孢菌素、荚膜和鞭毛结构时使用的菌龄有什么区别？(张应烙)